采用多参数表面等离子体共振(MP-SPR)仪器可以测定牛奶和乳基婴儿配方奶粉中蛋白质的浓度。α-乳清蛋白(ALAB)是婴儿重要的营养蛋白，免疫球蛋白G (IgG)是二次免疫应答的重要组成部分。根据校准曲线确定未知样品的浓度。该试验是使用固定在表面的抗alab抗体或抗igg抗体的直接结合试验。同样的分析格式可用于检测其他类似的感兴趣的蛋白质，如抗生素残留、毒素、过敏原或营养物质。

简述

       α-乳清蛋白(α-Lactalbumin, ALAB)是母乳中含量最多的乳清蛋白，对哺乳婴儿具有重要的营养价值。作为人源化过程的一部分，ALAB经常被添加到从牛奶中提取的婴儿配方奶粉中，它也可以用作低过敏性婴儿配方奶粉中水解的标记物。这使得牛奶中完整蛋白质的准确浓度测定成为主要的研究对象。

       牛奶中的IgG对人类致病性细菌具有特异性活性。牛奶中抗微生物因子的浓度对原料奶的保质期有影响，并可能提供额外的健康益处。

       多参数表面等离子体共振(MP-SPR)是构建复杂基质(如牛奶)免疫浓度测定的良好平台。成熟的SPR检测方法广泛应用于不同的免疫学研究，如抗体生产和生物制药药物开发中的动力学、亲和力和浓度测定。MP-SPR技术强大的流体设置和独特的光学配置可以对牛奶、海水、血浆、血清和唾液等粗样品进行分析。

材料和方法

       牛奶中ALAB和IgG定性浓度测定的直接检测方法改编自H. Indyk(2009)。测量使用全自动四通道MP-SPR Navi™420A ILVES仪器和BioNavis CMD-3D传感器载玻片进行。固定化方法为标准氨基偶联，包括活化NHS和EDC、蛋白偶联和CMD表面的乙醇胺失活。ALAB检测采用多克隆抗ALAB抗体(Bethyl Labs A10-128A)， IgG检测采用多克隆抗IgG抗体(Jackson ImmunoResearch 301-005-003)。校正标准为ALAB (Sigma-Aldrich L6010, 14 kDa)和牛IgG (Jackson ImmunoResearch 001-000-003, 150 kDa)。ALAB用HBS+T (Hepes缓冲盐水，含0.05% Tween 20)， IgG用PBS+T(磷酸盐缓冲盐水，含0.05% Tween 20)。分析物再生液为10 mM甘氨酸- hcl pH 2。使用TraceDrawer™for BioNavis v. 1.8分析数据。

       样品是从芬兰超市购买的不同的奶制品(图1)。粉末样品根据包装上的说明制备成液体形式，并进一步稀释1000或50倍(正常牛奶)和5000倍(婴儿产品)。使用90秒的样品注射(校准或牛奶样品)，120秒的等待时间和60秒的ALAB再生注射进行测量。IgG注射时间较长。ALAB的校准范围为0 - 1000 ng/mL, IgG的校准范围为0 - 75 000 ng/mL。校正曲线符合4参数Low-High方程，也可用于测定样品中的蛋白质浓度。

结果和讨论

      抗alab和抗igg抗体成功固定在CMD传感器表面。参考校正后的蛋白检测感图为典型的抗体-抗原相互作用曲线(图2)。校准浓度形成典型的校准图。ALAB样品在校准曲线上的位置相对均匀，而IgG浓度在所研究的乳制品中没有显示出太大的差异。ALAB和IgG浓度计算结果见表1和表2。

      在低过敏性奶粉配方(S3和S5)中几乎没有检测到ALAB蛋白。这是预料之中的，因为蛋白质已经被热水解，因此假定没有完整的ALAB保留下来。正常牛奶(S1)中ALAB的浓度最低，这也是意料之中的结果，因为ALAB通常只是出于营养原因添加到婴儿配方奶粉中。

结论

       MP-SPR是用免疫分析法测定蛋白质浓度的一个极好的平台。当使用高亲和力抗体时，该方法的灵敏度可轻松达到ng/mL。本文提出的方法也可用于其他乳蛋白，如β-乳球蛋白。MP-SPR不仅限于牛奶作为测量基质，还可用于其他与食品相关的基质，如果汁和洗脱的小麦粉，或其他粗样品，如100%血清、尿素和海水。